Topmusicanswers
Množstvo celkovej DNA v PCR má výrazný vplyv na výsledok postupu PCR. Použitie príliš veľkého množstva celkovej DNA má za následok zbalenú DNA v uzavretom priestore reakčnej nádoby a môže viesť k falošnému primingu a dokonca k zlej syntéze DNA v dôsledku prekážanej difúzie veľkých molekúl polymerázy Taq.
- Koľko šablóny mám pridať do PCR?
- Príliš veľa priméru môže inhibovať PCR?
- Čo môže spôsobiť zlyhanie reakcie PCR?
- Koľko DNA stačí na PCR?
Koľko šablóny mám pridať do PCR?
Aj keď by teoreticky stačila jedna molekula templátu, na klasickú PCR sa typicky používa podstatne väčšie množstvo DNA, napríklad až 1 µg genómovej DNA z cicavcov a len 1 pg plazmidovej DNA (1).
Príliš veľa priméru môže inhibovať PCR?
Kontaminanty v zmesi dNTP môžu viesť k neúplnej alebo nesprávnej amplifikácii alebo inhibícii PCR. Používajte vysokokvalitné dNTP. Použitie nadmernej koncentrácie primérov môže zvýšiť šancu, že sa priméry nešpecificky naviažu na nežiaduce miesta na templáte alebo navzájom.
Čo môže spôsobiť zlyhanie reakcie PCR?
Ak zabudnete iba jednu zložku reakcie PCR, či už ide o DNA polymerázu, priméry alebo dokonca templátovú DNA, bude to mať za následok neúspešnú reakciu. Najjednoduchším riešením je reakciu zopakovať. ... Ak ani potom produkt PCR neexistuje, je pravdepodobné, že vašej reakcii bráni niečo iné.
Koľko DNA stačí na PCR?
Pri typickej 50 µL reakcii stačia 1–2 jednotky DNA polymerázy na amplifikáciu cieľovej DNA. Môže však byť potrebné upraviť množstvo enzýmu pomocou ťažkých templátov. Pokiaľ sú napríklad vo vzorke DNA prítomné inhibítory, zvýšenie množstva DNA polymerázy môže zlepšiť výťažky PCR.
